ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

В настоящее время  одним из аспектов регенеративной медицины является получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).  Данные клетки могут быть использованы для выращивания органов и тканей либо омоложения уже устаревших тканей, органов или даже целых систем [1]. Впервые данные клетки были взяты из тератокарциномы, которая, в свою очередь, была получена с помощью пересадки эмбриональных клеток мыши в здоровый организм [2]. При этом, самой интересной частью данных исследований является то, что при пересадке клеток тератокарциномы в зародыш мыши– те принимают активное участие в развитии нового здорового организма (что указывает на их плюрипотентность);  а пересадка этих же клеток в здоровый организм вызывает образование все той же тератокарциномы (что демонстрирует влияние окружающих клеток на дифференцировку плюрипотентных). Таким образом, эти исследования позволили сделать два основных вывода: плюрипотентные клетки могут быть получены из соматических; окружение плюрипотентных клеток и продуцируемые этим окружением факторы вносят большой  вклад в характер их развития[3-5].

Дальнейшее развитие методики получения ИПСК было реализовано в работах японских ученых Такахаши и Яманака [6], которым удалось перепрограммировать клетки фибробластов в плюрипотентные, используя всего четыре фактора: Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc – которые в дальнейшем были названы «факторы Яманака». Данный метод и по сей день используется как основной и универсальный подход в репрограммировании клеток, однако, при решении практических задач регенеративной медицины он имеет ряд недостатков:

• Часто, разность транскрипционных факторов при репрограммировании клеток и факторов окружающих клеток не позволяет протекать нормальной дифференцировке ИСПК [7].
• Полученные таким образом клетки могут вызвать иммунный ответ у организма-реципиента (в частности, за это отвечает повышенный синтез иммуногенных факторов Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, Spt1, Lce3a,Chi3L4, Olr1, Retn) [8].
• Низкий выход ИСПК, получаемый из первичных культур клеток (~1 %) [9].
• Также нередки случаи злокачественного перерождения получившейся ткани, в результате образования онкогенных клеток (это может быть связано с низким уровнем экспрессии факторов PTEN и Nanog) [10].

Одним из способов решения данных проблем является получение клеток, образующихся в результате неоконченного процесса де-дифференцировки соматических клеток. Таким образом, получаются так называемые «промежуточные»  или прогениторные популяции клеток. Это приводит к их ограниченной дифференцировке, однако, существенный выигрыш в упрощении и ускорении методики, а также возможность получать более предсказуемый результат делает данные клетки привлекательным объектом для решения практических задач.

Таким образом, группе ученых из США и Испании удалось [11] создать высокоэффективный метод получения эндотелиальных и кроветворных клеток из фибробластов человека. Основным фактором транскрипции в данном случае является фактор SOX17, который играет ключевую роль в эмбриональном развитии сердечно-сосудистой и кроветворной систем. Как утверждают сами авторы, полученные линии не обладают выраженной онкогенностью, и, в свою очередь, обладают достаточным уровнем активности теломеразы, который предохраняет их от преждевременного старения.

Также особого внимания заслуживает метод прямой трансдифференцировки, заложенный еще в 1979 году учеными Тейлором и Джонсоном. Суть его заключается в воздействии всего одним фактором (например, 5-азацитидином) на бессмертную линию клеток эмбриональных фибробластов – способно вызвать образование миогенных, хондрогенных и адипогенных клонов [12]. Позже [13], было обнаружено, что для репрограммирования достаточно активации всего одного гена, позднее названного MyoD1. По сравнению с ИПСК, для получения которых требуется не менее двух недель, образование индуцированных прогениторных клеток происходит сравнительно быстро — иногда за несколько дней.

В настоящее время большое внимание уделяется сравнительно недавно открытой системе редактирования генома CRISPR-Cas9. Где белок Cas9 был изменен таким образом, что он больше не «режет» ДНК, но все ещё может находить и связываться с конкретными последовательностями ДНК. Связываясь с определенными активаторами транскрипции, данная система позволяет с большой точность регулировать экспрессию тех или иных факторов дифференцировки. Так, усиление экспрессии эндогенных генов Cdx2 и Gata6, позволило осуществить прямое репрограммирование мышиных эмбриональных стволовых клеток в две внезародышевые линии, а именно в типичные трофобласты и клетки внеэмбриональной энтодермы [14].

Еще одним изящным и остроумным методом стало введение в клетку полицистронной кассеты, содержащей факторы Яманаки, которая контролируемо активируется доксициклином. Это позволило индуцировать омоложение клеток короткими циклами. По словам самих авторов данное открытие показало, что старение не обязательно должно проходить в одном направлении. Оно обладает пластичностью, и при осторожной модуляции его можно обратить [15].

Также происходит поиск методов, позволяющих получить плюрипотентные клетки без генетических манипуляций. В одной из работ [16] было показано, что ингибитор Rho киназы – Y-27632, а также факторы, вызывающие индукцию перепрограммирования клеток, полученные в результате апоптоза облученной подложки из клеток, позволили получить из эпителиальных клеток так называемые «условно перепрограммированные клетки». Данный метод, по мнению авторов также является наиболее эффективным и минимизирует риск злокачественного перерождения полученных культур.

Не менее важным является изучение биофизических факторов в процессе дифференцировок клеток. Так, было показано, что физические сигналы, в виде параллельных микродорожек на поверхности подложки для культивации клеток, могут заменить действие низкомолекулярных эпигенетических модификаторов и значительно повысить эффективность перепрограммирования. Механизм основан на механомодуляции,изменяющей морфологию и эпигенетическое состояние клеток. В частности, по мнению авторов исследования: «снижение активности гистоновой дезацетилазы и повышение экспрессии WD повторяющего домена 5 (WDR5)-субъединицы H3 метилтрансферазы, вызванное поверхностью с микродорожками приводит к увеличению ацетилирования и метилирования гистона Н3». Аналогичное действие на клетки оказывали нановолоконные подложки с выровненной ориентацией волокон [17].

В целом, можно подытожить, что поиск оптимальных и эффективных методик получения ИПСК ведется в различных направлениях, и, скорее всего, получение универсального метода будет сопряжено с определенными трудностями, если вообще представится возможным. Однако, можно выявить основные критерии, по которым идет модификация, оптимизация и разработка методик: повышение продуктивности и выхода ИПСК из соматических клеток; минимизация риска злокачественного перерождения полученных клеток; упрощение технологии и минимизация факторов, воздействующих на соматические клетки; дешевизна и качество метода.

Список использованных источников:

1. Chung Y. G. et al. Human somatic cell nuclear transfer using adult cells //Cell stem cell. – 2014. – Т. 14. – №. – С. 777-780.
2. Shamblott M. J. et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1998. – Т. 95. – №. – С. 13726-13731.
3. Mintz B., Cronmiller C., Custer R. P. Somatic cell origin of teratocarcinomas //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1978. – Т. 75. – №. – С. 2834-2838.
4. Mintz B., Illmensee K. Normal genetically mosaic mice produced from malignant teratocarcinoma cells //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1975. – Т. 72. – №. – С. 3585-3589.
5. Martin G. R.,Evans M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1975. — Vol. 72,  4. — P. 1441—1445
6. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors //cell. – 2007. – Т. 131. – №. – С. 861-872.
7. Kunitomi A. et al. H1foo has a pivotal role in qualifying induced pluripotent stem cells //Stem cell reports. – 2016. – Т. 6. – №. – С. 825-833.
8. Zhao T. et al. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells //Nature. – 2011. – Т. 474. – №. – С. 212-215.
9. Tanabe K. et al. Maturation, not initiation, is the major roadblock during reprogramming toward pluripotency from human fibroblasts //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2013. – Т. 110. – №. – С. 12172-12179.
10. Tanabe K. et al. Maturation, not initiation, is the major roadblock during reprogramming toward pluripotency from human fibroblasts //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2013. – Т. 110. – №. – С. 12172-12179.
11. Zhang L. et al. SOX17 Regulates Conversion of Human Fibroblasts into Endothelial Cells and Erythroblasts via De-Differentiation into CD34+ Progenitor Cells //Circulation. – 2017. – С. CIRCULATIONAHA. 025722.
12. Taylor S. M., Jones P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T12 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine //Cell. – 1979. – Т. 17. – №. – С. 771-779.
13. Lassar A. B., Paterson B. M., Weintraub H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T12 fibroblasts to myoblasts //Cell. – 1986. – Т. 47. – №. – С. 649-656.
14. Black J. B. et al. Targeted epigenetic remodeling of endogenous loci by CRISPR/Cas9-based transcriptional activators directly converts fibroblasts to neuronal cells //Cell Stem Cell. – 2016. – Т. 19. – №. – С. 406-414.
15. Ocampo A. et al. In Vivo Amelioration of Age-Associated Hallmarks by Partial Reprogramming //Cell. – 2016. – Т. 167. – №. – С. 1719-1733. e12.
16. Kurosawa H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells //Journal of bioscience and bioengineering. – 2012. – Т. 114. – №. – С. 577-581.
17. Downing T. L. et al. Biophysical regulation of epigenetic state and cell reprogramming //Nature materials. – 2013. – Т. 12. – №. – С. 1154-1162.
18. Buganim Y., Faddah D. A., Jaenisch R. Mechanisms and models of somatic cell reprogramming //Nature Reviews Genetics. – 2013. – Т. 14. – №. 6. – С. 427-439.

---

© Матвей Матвеенков, лаборант лаборатории комбинированных воздействий